轉自BioAr，zZ原創(chuàng )
Nature綜述文章：Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy
多年來(lái)，細胞生物學(xué)家們一直在嘗試不同的技術(shù)來(lái)對細胞進(jìn)行成像，并期望從時(shí)間和空間尺度上理解細胞行為。然而，這些成像技術(shù)的分辨率很少能夠達到足以讓人們理解其中化學(xué)反應的程度。冷凍電子顯微鏡的出現極大地促進(jìn)了人們對細胞內大分子功能型復合物的理解，它所能達到的超高分辨率可以為解釋細胞運作提供更加細節的化學(xué)視角。
近日，來(lái)自加州大學(xué)伯克利的Eva Nogales和來(lái)自歐洲分子生物實(shí)驗室的Julia Mahamid在Nature上發(fā)表了題為Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy的綜述。該文章主要探討了冷凍電子顯微鏡(cryo-EM, cryo-electron microscopy) 和冷凍電子斷層掃描 (cryo-ET, cryo-electron tomography) 之間的異同，以及冷凍電鏡的整體發(fā)展和其在細胞生物學(xué)中的應用。
作者首先對cryo-EM和cryo-ET的異同進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。Cryo-EM的技術(shù)最早可以追溯到上世紀五六十年代，隨著(zhù)幾十年來(lái)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，cryo-EM成為了解析生物大分子的強大工具。相比于X射線(xiàn)晶體衍射和核磁共振波譜，cryo-EM通常需要更少的樣品材料，并且對于分子的大小要求也沒(méi)有上限。與cryo-EM分離純化樣品分子不同，cryo-ET通常在復雜的細胞環(huán)境內對分子進(jìn)行原位成像；cryo-EM一般獲得單張分子圖像，而cryo-ET一般獲得不同角度的圖像序列，這些圖像序列可以通過(guò)分析獲得三維的分子結構。因此，cryo-EM的研究對象一般在組成和構象變化方面相對簡(jiǎn)單，而cryo-ET的研究對象相對來(lái)說(shuō)會(huì )有更高階的組裝模式。
接下來(lái)，作者提到，近年來(lái)冷凍電鏡的技術(shù)發(fā)展主要體現在探測器的發(fā)展、樣品處理和新型軟件平臺的開(kāi)發(fā)：(1) 直接電子探測器 (DED, direct electron detector) 的發(fā)展極大地提高了圖像的對比度和分辨率，(2) 聚焦離子束切割 (FIB, focused ion beam) 的應用與傳統冷凍切片相比，大大減少了對樣品的干擾，(3) 新型軟件平臺的創(chuàng )新進(jìn)一步促進(jìn)了cryo-EM的精確數據分析。
隨著(zhù)冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展，目前冷凍電鏡可以處理的樣品也逐漸復雜化。相比于傳統的X射線(xiàn)晶體衍射常用的過(guò)表達蛋白后再純化相比，由于冷凍電鏡需要的樣品量較少，人們可以直接利用CRISPR技術(shù)將內源蛋白連上標簽后直接純化內源蛋白，這樣可以保證最后分析的蛋白最接近體內的真實(shí)狀態(tài)。而對于復雜的蛋白復合物，則需要利用cryo-ET并且結合一系列計算程序來(lái)盡可能確保結構的可信度。另一方面，人們也在放寬對蛋白提取的純度要求，而轉向對細胞裂解物等粗提樣品進(jìn)行粗略的結構分析，這種方法可以有助于復雜混合物的初始模型構建。除了對樣品進(jìn)行體外分析之外，直接研究細胞樣品可以提供更偏向真實(shí)生理的信息。冷凍電鏡已經(jīng)在細胞切片 (FIB) 中有顯著(zhù)的進(jìn)展，如果研究者想觀(guān)察整個(gè)細胞或組織的話(huà)，將FIB切割和掃描電子顯微鏡 (FIB-SEM) 結合起來(lái)，再通過(guò)圖像處理可以獲得保真的超分辨電鏡細胞圖像。
當研究者獲得復雜的細胞圖像后，他們需要對細胞內的分子進(jìn)行辨別和區分。通常有兩種方法可以被用來(lái)定性這些分子：(1) 光電聯(lián)合顯微鏡 (CLEM, correlated light and electron microscopy)，通過(guò)對目標分子連上熒光分子來(lái)區分目標分子和其他結構；(2) 利用分子標簽來(lái)直接指示目標分子的位置，可以是電子顆粒密度的差別也可以是目標分子的特殊結構。當然，為了獲得更保真的超微結構，以上這些都離不開(kāi)更細致的數據分析手段。
Fig 1. 用cryo-ET可視化細胞結構。
最后，作者介紹了cryo-EM和cryo-ET的結合應用。由于cryo-ET的結構分辨率通常低于cryo-EM, 而cryo-ET可以對接近生理狀態(tài)下的細胞或組織成像，這兩種方法的互相補充可以用于解釋和補充低分辨率的cryo-ET圖像。例如，當cryo-ET獲得的細胞圖像尚未達到足以讓系統預測其中復合物的程度時(shí)，cryo-EM獲得的高分辨率結構模版可以幫助cryo-ET在原位細胞中辨別目標復合物。辨別的方法有兩種：(1) 在cryo-ET獲得的3D結構中直接進(jìn)行模版匹配，但由于cryo-ET的分辨率限制，人們也可以 (2) 眾多切片中的單個(gè)高分辨率圖像中進(jìn)行2D模版匹配。但在更多情況下，這兩種方法會(huì )同時(shí)進(jìn)行，相輔相成以確保預測的準確度。另外，cryo-ET也可以與細胞的熒光成像甚至是單細胞組學(xué)數據結合，為細胞調控提供全新的機制性理解。
提到近來(lái)的結構生物學(xué)發(fā)展，便不可不提蛋白結構預測領(lǐng)域中人工智能 (如AlphaFold或RosettaFold) 的廣泛應用。盡管可能有人擔心實(shí)驗性結構生物學(xué)可能將被人工智能代替，但作者表示人工智能預測蛋白結構可以是實(shí)驗性結構生物學(xué)的強大助力。將人工智能的預測與cryo-EM或cryo-ET獲得的電子密度圖結合，這樣的實(shí)驗流程將會(huì )顯著(zhù)加速結構模型的建立，并使得解釋捕獲的真實(shí)細胞內的分子結構的過(guò)程更加便捷。
總而言之，細胞生物學(xué)和結構生物學(xué)的互補是人們理解細胞世界不可或缺的途徑，而冷凍電鏡的發(fā)展將會(huì )使人們對真實(shí)細胞活動(dòng)的理解上升到另一個(gè)超微尺度。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07198-2
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