1.抗體的制備：
?? 特異性高、親和力強的高效價(jià)抗體是獲得理想的免疫標記結果的首要條件要?？贵w可購買(mǎi)或自己制備。大分子完全抗原，可直接免疫動(dòng)物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠來(lái)獲得抗體。半抗原，用偶聯(lián)劑使半抗原與大分子物質(zhì)結合成復合物，再去免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體，大分子物質(zhì)稱(chēng)為載體蛋白，以甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白或血藍蛋白最為常用。偶聯(lián)劑為戊二醛或碳二酰亞胺等。目前細胞雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體最為理想。
2.標本的處理
A、為了既能將抗原準確定位甚至定量，又能觀(guān)察到近似于生活狀態(tài)下的細胞超微結構，必須選擇合適的固定劑，慎重處理樣品。
1）單細胞：培養細胞或血細胞應隨用隨取。懸浮培養細胞可先離心（800 rpm，5 min），用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗1次后進(jìn)行固定。貼壁細胞則可先將其培養在玻片上，用PBS輕輕沖洗后立即固定，也可用胰酶將細胞消化下來(lái)，按懸浮培養細胞的制備方法制備。
2）組織：取組織塊時(shí)做到越快越好，最好在沒(méi)有停止血流前就取材。若觀(guān)察的對象為肺、大腦、脊髓或內分泌器官等比較柔軟的組織，應先做灌注固定，再用銳利的刀片將其切成約2 mm×2 mm×l mm大小的組織塊，切時(shí)要避免擠壓與牽拉，然后投入到固定液中繼續固定。
3）固定： 固定劑常會(huì )對抗原的活性產(chǎn)生不同程度影響，為了保存細胞的超微結構和抗原的活性，應通過(guò)預試驗，確定固定劑的種類(lèi)、濃度、溫度、pH及固定時(shí)間和方式，可用已知效價(jià)的抗原進(jìn)行試驗，選擇合適的固定方法。
B、以下是常用的免疫電鏡標本固定液的類(lèi)型
（1）多聚甲醛-戊二醛固定液（簡(jiǎn)稱(chēng)PG）：1％多聚甲醛對組織細胞的抗原性影響不大，若加入超過(guò)0.1％戊二醛，抗原性就會(huì )迅速減弱；當戊二醛的濃度低到0.01％～0.05％時(shí)，對抗原性的影響便不顯著(zhù)，而細胞超微結構的保存也可獲得很大改善。所以推薦用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作為免疫電鏡標本的固定劑，固定時(shí)間為4～5 h。對有些抗原性較強的標本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛進(jìn)行固定。某些抗原對戊二醛極其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充分的固定會(huì )造成抗原提取或移位，同時(shí)醛類(lèi)等交聯(lián)固定劑會(huì )改變蛋白質(zhì)分子的結構而影響其抗原性，所以在不明顯影響抗原性的前提下，選擇合適的固定濃度和時(shí)間，盡可能強一些為好。
（2）過(guò)碘酸鹽-賴(lài)氨酸-多聚甲醛混合固定液（簡(jiǎn)稱(chēng)PLP）：PLP液含0.01 mol/L過(guò)碘酸鈉、0.075mol/L賴(lài)氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸緩沖液。其機制是借助過(guò)碘酸鹽氧化抗原，一般為糖蛋白的糖類(lèi)部分，使其羥基變?yōu)槿┗?，這樣賴(lài)氨酸的雙價(jià)氨基就能與醛基結合從而把抗原交聯(lián)起來(lái)。由于大多數組織抗原含蛋白質(zhì)與糖類(lèi)，抗原決定簇位于蛋白部分，該固定劑有選擇性地固定糖類(lèi)，這樣既穩定了抗原，又不影響抗原決定簇與抗體的結合。加入低濃度的多聚甲醛則能穩定蛋白與脂類(lèi)。因為賴(lài)氨酸價(jià)格較貴，此固定液不如PG固定液經(jīng)濟。
（3）苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（簡(jiǎn)稱(chēng)PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH為7.3?？辔端岽┩秆杆?，可在不影響抗原活性的前提下固定蛋白質(zhì)，改善對膜和胞質(zhì)的保存。特別是不能采用高濃度的戊二醛與鋨酸做后固定時(shí)（如包埋后的免疫標記），在前固定液中加入苦味酸對超微結構的保存有很大幫助。
C、固定方法與時(shí)間
1）灌注固定：這是固定效果最好的方式，能使超微結構得到很好的保存。以大鼠為例，麻醉后，用注射針頭經(jīng)左心室向主動(dòng)脈灌注固定液，靜脈壓為120mm Hg柱，在5～15 min內每200g體重灌注150 ml固定液。
2）浸沒(méi)固定：將手術(shù)或灌注后切成的標本塊浸沒(méi)在固定液中固定，浸沒(méi)固定時(shí)間常為2～5h，游離細胞固定0.5～1h。
3）包埋，包埋劑類(lèi)型：環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑和低溫包埋劑。
1）包埋前免疫標記
即對已固定的樣品先進(jìn)行免疫標記，然后進(jìn)行包埋、超薄切片并觀(guān)察結果，一般選用環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑。環(huán)氧樹(shù)脂本質(zhì)是疏水性的，在包埋前樣品必須先進(jìn)行完全脫水，然后在溫箱中進(jìn)行熱聚合。熱聚合會(huì )使大多數抗原變性，因此該包埋劑不適用于包埋后免疫標記。
2）包埋后免疫標記
指組織標本經(jīng)固定及樹(shù)脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)標記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRGold包埋劑。這三種包埋劑均能在低溫下（-35℃～-80℃）用紫外光（波長(cháng)315～360nm）進(jìn)行聚合，避免了高溫對抗原性的負面影響，提高了陽(yáng)性標記率，而且對膠體金的非特異性吸附少，對溫度敏感的抗原應選擇使用低溫包埋劑。
3.免疫標記
根據免疫標記與標本包埋之間的不同關(guān)系，可分為包埋前免疫標記、包埋后免疫標記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標記。根據具體的標本、抗原的部位及性質(zhì)并結合實(shí)驗室的具體條件選擇恰當的方法。這三種免疫標記方法，都包括非特異性位點(diǎn)的封閉、抗體與抗原特異性結合的免疫反應、反應部位的示蹤顯示等基本步驟。
1）包埋前免疫標記
?? 優(yōu)點(diǎn)一是切片在免疫標記前不經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹(shù)脂包埋及高溫聚合的過(guò)程，抗原活性不會(huì )受到上述過(guò)程的影響，而且抗原暴露充分，標記的陽(yáng)性率高，非特異性反應少。優(yōu)點(diǎn)二是免疫標記后還可進(jìn)行半薄切片，在免疫反應陽(yáng)性部位做定位超薄切片，進(jìn)一步提高電鏡的檢出率。優(yōu)點(diǎn)三是免疫標記完畢后，用戊二醛與鋨酸再次固定組織，可使抗原抗體的結合更加牢固，并有利于膜結構的保存。
?? 包埋前免疫標記主要用于細胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脫水劑和樹(shù)脂成分溶解和變性的抗原的檢測。包埋前免疫標記細胞內抗原受到標記抗體的穿透性限制，為了提高對細胞內抗原的標記率可以采取以下措施：
（1）厚切片
?? 厚切片進(jìn)行包埋前免疫標記，需將固定后的組織厚切片（單細胞團不需厚切片），以利于標記抗體的穿透。厚切片的方法有以下幾種：
1) 冰凍切片
用恒冷箱冰凍切片機將固定后的組織塊切成8μm左右的厚片。將切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶?jì)葌溆?。也有的將厚片直接貼在載玻片上進(jìn)行免疫標記，這樣做雖然操作比較方便，但因抗體只能與厚片的一面接觸，所以會(huì )在一定程度上影響標記的陽(yáng)性率。
2) 振動(dòng)切片
振動(dòng)切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫電鏡用只需20μm～80μm的切片。振動(dòng)切片的優(yōu)點(diǎn)是可以避免冰凍對組織帶來(lái)的損害，但它切出來(lái)的切片過(guò)厚，即使在使用穿透劑的條件下，免疫試劑也僅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深層的組織就不易被標記。
（2）增加細胞膜的通透性
?? 用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性劑處理5～8min，以增加細胞膜的通透性。但這些化學(xué)物質(zhì)會(huì )對超微結構產(chǎn)生一定程度的破壞，所以應根據不同的組織或細胞，嚴格控制活性劑的應用濃度與時(shí)間。也可用凍融的方法增加細胞膜通透性，標本先進(jìn)行防冰晶處理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振搖沉底），在液氮中速凍0.5～1min后用PBS迅速回溫。
（3）選用相對分子質(zhì)量較小的標記物
?? 辣根過(guò)氧化物酶與IgG的Fab片段交聯(lián)物，分子質(zhì)量較小，約100kD，較易進(jìn)入細胞內。也可用IgG Fab-lnm金作為標記物，標記后經(jīng)銀加強染色的納金包埋前標記法。由于該標記物較易穿透到組織和細胞內，且定位比酶標抗體精確，因此被廣泛用于膜受體的精確定位。
2）包埋后免疫標記
?? 包埋后免疫標記具有超微結構保存較好、方法簡(jiǎn)便可靠、陽(yáng)性結果重復性高的優(yōu)點(diǎn)，可對同一組織塊的連續切片做各種對照免疫標記，能十分準確地解釋免疫標記結果，而且還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫標記，尤其適合于顆粒性標記物（膠體金標記）的免疫化學(xué)定位標記，是目前應用最廣的免疫電鏡技術(shù)。但是該方法也有明顯的缺點(diǎn)，抗原在脫水、浸透及樹(shù)脂包埋過(guò)程中可能被破壞，且抗原被樹(shù)脂遮蓋不易與抗體接觸，使免疫標記的陽(yáng)性率下降。尤其是后固定劑鋨酸對抗原的破壞較嚴重，因此常常避免使用。為了得到精細的超微結構并提高陽(yáng)性標記率，必須注意以下幾個(gè)方面：
3）冷凍超薄切片免疫標記
冷凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)的特點(diǎn)是組織不經(jīng)脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態(tài)下進(jìn)行超薄切片，然后進(jìn)行免疫標記。該項技術(shù)克服了上述兩種方法的缺點(diǎn)，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標記的敏感性，但在冷凍過(guò)程中超微結構會(huì )受到冰晶的破壞。1996年，LiouW等改良了冷凍超薄切片技術(shù)，用甲基纖維素和醋酸鈾混合液（含1.5％～2％甲基纖維素，0.3％～3％醋酸鈾的水溶液）代替傳統的蔗糖溶液作為將冷凍切片從冷凍槽中轉移到鎳網(wǎng)上的溶液，得到了保存良好的超微結構，使該項技術(shù)更加完美，應用也越來(lái)越廣泛。但該項技術(shù)必須有特殊的冷凍超薄切片機，且技術(shù)難度較高。
4.對照實(shí)驗
?? 為了證實(shí)免疫標記結果的特異性，必須同時(shí)進(jìn)行對照實(shí)驗。在抗體的特異性無(wú)問(wèn)題的前提下，對照實(shí)驗有以下幾種：
??? 用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物正常血清代替第一抗體，結果應為陰性。 不加一抗，結果應為陰性。 用不含有靶抗原的標本進(jìn)行免疫標記，結果應為陰性。 對肯定含有靶抗原的標本進(jìn)行免疫標記，結果應為陽(yáng)性。
5.結果的觀(guān)察和解析
?? 在電鏡下觀(guān)察免疫標記的結果，通過(guò)標記物（膠體金、鐵蛋白或酶底物）顯示免疫反應部位以定位抗原的存在位置，注意區分特異性標記和背景的非特異性標記，進(jìn)行正確的結果分析。
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