1、預檢查和調節
(1) 在每次進(jìn)行熒光觀(guān)測前, 必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場(chǎng)光闌設置等狀況。
(2) 所需要的熒光激發(fā)/ 發(fā)射濾光片組件是否已裝在轉換器中, 物鏡配置是否得當, 除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。
(3) 如同時(shí)進(jìn)行透射光相差觀(guān)察, 要檢查聚光鏡對中心及相差環(huán)與物鏡相反的共軛情況。
(4) 檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿) 有否掛有液體、灰塵, 厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內。切片樣品不能太厚, 約≤10μm 為宜。
(5) 因照明光源含有紫外線(xiàn), 在載物臺前上方放一塊棕色遮光板, 以防紫外線(xiàn)損傷視網(wǎng)膜。
(6) 電壓不穩會(huì )降低高壓汞燈的使用壽命, 光源電源最好加配穩壓器。
(7) 為延長(cháng)汞燈壽命, 在開(kāi)啟后15 min 方可關(guān)閉; 汞燈熒光電源一旦關(guān)閉, 再次啟動(dòng)至少需等待10 min，以使水銀蒸汽冷卻復至原態(tài), 否則會(huì )影響燈的壽命。
2、熒光鏡像觀(guān)察
(1) 在開(kāi)啟熒光燈源后約5～10min 激發(fā)光強度趨于穩定, 裝載樣品進(jìn)行觀(guān)察; 為防止在調焦和尋找物像過(guò)程中過(guò)度激發(fā)光照會(huì )造成樣品熒光淬滅, 最好先通過(guò)縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND 濾光片將激發(fā)光調節到適度強度, 有規律地移動(dòng)樣品臺, 待確定鏡像后, 再調節到最佳熒光狀態(tài)用于拍攝記錄。
(2) 鏡像質(zhì)量不佳的調整。排除樣品制備因素外, 可進(jìn)行的必要調節措施是:
a 排除成像光路中的遮光或限光器件, 如DIC 附件、ND 濾光片等。
b 重新調節熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。
c 細心調節物鏡覆蓋差校正環(huán)。
d 復查熒光激發(fā)/發(fā)射組件是否與所標記的熒光色素對應。
(3) 在不影響分辨率的前提下, 于照相取景框和CCD靶面范圍之外, 可盡量回縮熒光光路視場(chǎng)光闌和物鏡(100X 物鏡) 的數值孔徑光闌調節環(huán), 以避免雜散光的影響、提高景深, 并可減小激發(fā)面積防止附加樣品淬滅。
(4) 暫時(shí)不觀(guān)察時(shí), 應阻斷激發(fā)光路。
(5) 油鏡觀(guān)察時(shí), 須用“無(wú)熒光油”, 尤其是在U、V 激發(fā)時(shí), 因常規鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。
3、熒光照相和數字CCD 相機圖像采集
A、熒光照相
1)盡管肉眼觀(guān)察熒光鏡像亮度與普通明場(chǎng)相差無(wú)幾, 而實(shí)際上曝光時(shí)間要增加數倍甚至幾十倍, 應使用快速感光膠片, 如ISO200 ( 24DIN ) 、ISO400(27DIN) 。
2)根據熒光物像在測光區的分布比例和鏡像的明暗程度設置曝光補償調節, 原則上適當增大補償以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。
3)如果沒(méi)有照明標線(xiàn)取景器, 可先選擇較明亮的熒光區域進(jìn)行對焦調整。
4)對點(diǎn)狀熒光物像或撲捉某點(diǎn)為主的拍攝, 可選擇適當的點(diǎn)測光模式。
5)對在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點(diǎn)狀熒光物像, 可試用點(diǎn)測光配合自動(dòng)鎖定方式拍攝。
6)曝光過(guò)程應避免任何振動(dòng), 有條件可配置防震臺。
B、數字CCD 相機圖像采集
1)光學(xué)接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。
2)采用合適的熒光拍攝模式, 摸索減背景(Background Subtraction) 處理條件, 根據鏡像情況設置Binning、Gain、Gamma 等參數。
3)因CCD 芯片靈敏度較高,如果熒光鏡像過(guò)于明亮,為獲取對比度較好的采集圖像,可適當縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片, 特別是在熒光輝光較強影響拍攝樣品細節的情況時(shí)。
實(shí)際工作中,為獲得較好的熒光圖像拍攝質(zhì)量,需要對上述調節機制綜合運用,反復摸索、優(yōu)化條件。
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