一、免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）??????????????????????????????????????
1、原理和特點(diǎn)
?? 原理：利用抗原與抗體的特異性結合原理和特殊的標記技術(shù)，通過(guò)化學(xué)反應使標記抗體顯色，對組織細胞內的特異性抗原進(jìn)行定位、定性、定量檢測的一門(mén)技術(shù)。
?? 特點(diǎn)：免疫組化具有操作簡(jiǎn)單，特異性強，敏感性高，定位準確，形態(tài)與功能相結合等特點(diǎn)。
2、示意圖：???????????????
?辣根過(guò)氧化物酶（HRP）
3、常見(jiàn)問(wèn)題分析：
A.顯色過(guò)深
?? 一抗濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)，建議降低一抗濃度或減少孵育時(shí)間。
?? 孵育溫度過(guò)高，建議室溫或4℃孵育。
?? HRP標記二抗孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)，建議縮短時(shí)間。
B. 非特異性顯色
?? 石蠟切片脫蠟不徹底，建議延長(cháng)脫蠟時(shí)間。
?? 操作過(guò)程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數與沖洗時(shí)間。
?? 組織富含內源性的生物素與過(guò)氧化物酶，建議使用相關(guān)試劑進(jìn)行封閉。
?? 發(fā)生抗原異位。
?? 蛋白封閉不充分，建議增加蛋白封閉時(shí)間。
C. 顯色強度弱
?? 一抗濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短，建議增加一抗濃度或延長(cháng)孵育時(shí)間。
?? 試劑超過(guò)保質(zhì)期，建議實(shí)驗前確認試劑的保質(zhì)期。
操作過(guò)程沖洗過(guò)度，建議適度沖洗。
D. 無(wú)染色
?? 組織中無(wú)目的抗原的表達。
?? 一抗種屬來(lái)源與二抗不匹配，建議實(shí)驗前確認一抗的種屬來(lái)源。
?? 顯色物質(zhì)與HRP系統不匹配，建議實(shí)驗前確認顯色體系。
二、免疫熒光（Immunofluorescence,IF）
1、原理和特點(diǎn)：
?? 原理：免疫熒光就是利用抗原與抗體的特異性結合原理及特殊的熒光素標記技術(shù)，通過(guò)激光激發(fā)使熒光素發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光的變化從而對細胞內的抗原進(jìn)行分析的技術(shù)。用免疫熒光顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細胞（或組織）技術(shù)。
?? 特點(diǎn)：免疫熒光具有特異性強、敏感性高、速度快等特點(diǎn)。
2、原理示意圖：
3、實(shí)驗流程：
4、常見(jiàn)問(wèn)題分析：
A、背景過(guò)高
?? 一抗質(zhì)量不高，建議使用特異性高、效價(jià)高的一抗。
?? 一抗/二抗濃度太高，建議降低一抗/二抗濃度。
?? 封閉不完全，建議增加蛋白封閉時(shí)間。
?? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數與時(shí)間。
?? 可通過(guò)調節熒光顯微鏡的參數來(lái)減低背景。
B、信號弱或無(wú)信號
?? 無(wú)目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞或組織。
?? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。
?? 一抗/二抗濃度太低，建議增大其濃度。
?? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、熒光猝滅快
?? 熒光素本身特性決定，光穩定性差，建議選用光穩定性好的熒光素二抗。
?? 用普通的封片劑封片，建議選用防熒光猝滅劑封片。
D、細胞有自發(fā)熒光
?? 使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。
?? 材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光，建議設立陰性對照，通過(guò)降低熒光顯微鏡的參數來(lái)消除背景染色。?
?? 細胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細胞色素等）的含量高；培養細胞中死細胞／活細胞比例高；
三、流式細胞術(shù)（Flow Cytometry,? FC）
1、定義、原理
?? 流式細胞儀（FLOW CYTOMETOR）：
??? 進(jìn)行流式細胞分析的儀器，是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學(xué)，抗體技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。
?? 流式細胞術(shù)（FLOW CYTOMETRY）：?
利用流式細胞儀對處于快速流動(dòng)的細胞或生物顆粒進(jìn)行多參數、快速（每秒可達1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達99%以上）的技術(shù)。
2、反應原理示意圖：熒光物質(zhì)（FITC、PE等）
3、實(shí)驗流程：
4、常見(jiàn)問(wèn)題分析：
A、熒光強度/背景過(guò)高
?? 一抗/二抗濃度太高，建議降低一抗/二抗濃度。
?? 封閉不完全，建議增加蛋白封閉時(shí)間。
?? 洗滌不充分，建議增加沖洗次數與時(shí)間。
B、信號弱或無(wú)信號
?? 無(wú)目的蛋白或表達量極少，建議選用表達量高的細胞。
?? 細胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。
?? 一抗/二抗濃度太低，建議增大其濃度。
?? 二抗選擇錯誤（種屬不匹配），建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。
C、柱形圖分析時(shí)出現熒光雙峰
?? 抗原本身特性所決定（比如不同時(shí)期的細胞蛋白表達量不同）
?? 進(jìn)樣針堵塞，建議清洗管路。
?? 進(jìn)樣速度太快，建議調低進(jìn)樣速度。
D、管路系統偏移導致焦距偏離，建議請專(zhuān)業(yè)維修人員校準。
四、免疫組化（IHC）、免疫熒光(IF)、流式細胞術(shù)區別(FC)：
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流式細胞術(shù)（FC） |
免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF） |
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控制 |
電腦（客觀(guān)） |
人（主觀(guān)） |
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結果顯示方式 |
熒光激發(fā)后被探測子捕獲信號 |
化學(xué)顯色/熒光通過(guò)顯微鏡觀(guān)察拍片 |
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樣本 |
單細胞（或顆粒）懸液（流動(dòng)） |
組織切片/細胞爬片（靜止） |
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細胞數量 |
大（上萬(wàn)個(gè)） |
小 |
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樣本利用 |
分選后可回收利用 |
不可回收利用 |
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結果揭示信息 |
細胞群體特征分布 |
揭示細胞內部結構信息 |
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功能 |
可同時(shí)檢測多個(gè)參數 |
一個(gè)或幾個(gè)參數 |
| 電話(huà) 010-52571502 010-51248120 郵箱 hedebio@163.com |
